Neurochip 2000

Problemstellung

Die pharmakologische Forschung entwickelt hunderttausende von Substanzen, die auf ihre Wirkung und mögliche Nebeneffekte durch aufwendige Verfahren und klinische Studien kostpielig getestet werden müssen. Bereits für Toxizitätsmessungen sind häufig langwierige Tierversuchsreihen erforderlich. Differenzierte Untersuchungen der spezifischen Wirkungen auf zentralnervöse Strukturen sind kompliziert und nur beschränkt möglich. Wünschenswert sind Verfahren, die schnell und einfach ein Screening von Substanzreihen ermöglichen, dabei Wirkungsprofile abschätzen und automatisch Dosis-Wirkungskurven ermitteln lassen.

Prinzipspiketrace

Neuroscreening nutzt Aktivitätsmuster in neuronalen Verbänden, die abhängig sind von der synaptischen Verschaltung (Effizienz) und den neuronalen Eigenschaften (Erregbarkeit). Bereits in kleinen neuronalen Zellverbänden lassen sich verschiedene, Aktivitätszustände stabil durch die extrazellulären Ionenkonzentrationen einstellen (Abb.: Elektrophysiologische Messung in hippocampaler Zellkultur unter verschiedenen extrazellulären Bedingungen (Membranpotential abstatespacegeleitet im Patch-Clamp).

Theoretische Überlegungen zeigen, daß die Zustände erhöhter Aktivität (u.a. Oszillationen) durch die Interaktion der Neuronen über hinreichend starke synaptische Kopplung möglich werden. Relativ zur synaptischen Effizienz hängt von der neuronalen Erregbarkeit ab, welcher Zustand im Zellverband auftritt. Aus Modellsimulationen wurden die Abhängigkeiten für die intrinsischen Aktivitätszustände ermittelt.

 

 

spikerateOberes Bild: Modellsimulation: Abhängigkeit der mittleren Aktivität im Netzwerk von der synaptischen Kopplung. Drei stabile Netzwerkzustände treten auf: (I) geringes, unkorreliertes Spiken, (II) periodisches, synchronisiertes Bursten, (III) kontinuerliches, unkorreliertes Spiken. Unteres Bild: Zeitaufgelöste mittlere Aktivität des Modellnetzwerkes.

 

statespace3d

 

Zustandsraum für intrinsische Aktivität. Die Bereiche der chrakteristischen Aktivitätszustände sind scharf voneinander getrennt. Die Meßgröße 2PR quantifiziert Zustand II.

 

 

Substanztestung

Zur Wirkungstestung von unbekannten Substanzen eignet sich insbesondere der hochreproduzierbare, oszillatorische Zustand (II). Charakteristisch sind Frequenzen im Bereich ~ 0.1 – 2 Hz und hohe Periodizität. Wird ein solcher Zustand stabil eingestellt, so kann die Veränderung zur Situation mit Testsubstanz ermittelt werden. Dosis-Wirkungskurven sind durch repetitiven Ablauf möglich.

Realisierung

Auf Multi-Elektroden-Arrays (MEA, Abbn. unten) gezüchtete Zellkulturen erlauben einfache Ableitungen der elektrischen Netzwerkaktivität. Pro Kontakt wird die Summenaktivität mehrerer Zellen erfaßt. Zusammen mit der hohen Zahl an Ableitpunkten ist eine stabile Registrierung der Aktivität möglich. In Kombination mit Austauschsystemen für die extrazelluläre Lösung kann der Prozeß aus Kalibrierung der Kontrolloszillation, Zugabe der Testsubstanz und Analyse der Substanzwirkung automatisiert werden.

A) Kontrollzustand (Zustand II) eingestellt in definierter Ionenlösung. B) Zugabe von 100 nM Apamin: Die Oszillationsfrequenz nimmt ab. C) Zugabe von 10 nM Charybdotoxin: Die Oszillationsfrequenz sinkt weiter. D) Zugabe von 100 µM 4-Aminopyridin: Die Oszillation geht in inkohärente, hohe Aktivität über (Zustand III). E) Substanzwirkung ist reversibel, Auswaschen der Substanzen führt in diesem Fall wieder zur Kontrolloszillation
spiketracelong

Multi-Elektroden-Array (MEA). Aufnahmefeld aus 60 Elektroden, Abstand 200 µm, Hersteller: NMI, Reutlingen
MEAtotal
Kultur aus cortikalen Neuronen auf MEA, 6 Tage alt.
MEAelectrode
Cortikale Kultur,  DAPI-Färbung zeigt Neurone auf den Kontakten
cellphoto
Fazit

Das Neuroscreening-Verfahren ermöglicht, Veränderungen an grundlegenden intrinsischen Funktionen neuronaler Zellverbände zu detektieren und bietet die Option auf einen automatisierten Prozeß. Damit unterstützt Neuroscreening optimal die Erfordernisse pharmakologischen Screenings.

Last modified 05/18/07 11:48                             Upward